Cómo leer un
cromatograma
de HPLC:
paso a paso

La mayoría de las personas que reciben un COA de péptido miran el número de pureza y siguen adelante. Es comprensible, pero ese número sin el gráfico que lo respalda no certifica nada. El cromatograma es la huella analítica del proceso: el gráfico de la señal del detector en función del tiempo, mientras los componentes de la muestra salen de la columna separados uno a uno. Cada pico que aparece corresponde a un componente de la mezcla; el área bajo ese pico es proporcional a su cantidad. Saber leer ese gráfico convierte la verificación en algo concreto y objetivo, en lugar de una confianza a ciegas en el documento de un proveedor.

Qué representa cada eje del cromatograma

Antes de los pasos, conviene entender la estructura básica del gráfico. El eje horizontal (X) es el tiempo de retención, expresado en minutos: el tiempo que tarda cada componente en recorrer la columna cromatográfica desde la inyección hasta el detector. El eje vertical (Y) es la respuesta del detector, habitualmente señal UV en miliabsorbance units (mAU). Para péptidos, el detector se ajusta a 215–220 nm, longitud de onda que capta el enlace peptídico con alta sensibilidad.

Cuando un componente llega al detector, la señal sube y forma un pico; cuando ese componente pasa completamente, la señal baja de nuevo. El conjunto de estos picos a lo largo del tiempo es el cromatograma. El software del instrumento integra el área bajo cada pico, suma todas las áreas y calcula el porcentaje de cada una: ese porcentaje del pico principal es la pureza declarada en el COA.

Los cuatro pasos para leer un cromatograma de HPLC

El proceso de lectura tiene un orden lógico. Saltarse el primer paso y ir directamente al pico principal es un error frecuente: si la línea base no es fiable, todo lo que viene después también está comprometido.

1. 1 Paso
   Evalúa la línea base

   La línea base es la señal del detector cuando no elúye ningún componente de la columna: el tramo horizontal que aparece al comienzo del análisis, antes de los primeros picos, y al final, después del último pico. Debe ser plana y estable, con el mínimo de ruido posible. Una línea base con oscilaciones, con una deriva ascendente sostenida o con picos erráticos indica problemas técnicos en la ejecución del análisis: una columna deteriorada, solventes contaminados, temperatura inestable o un equipo con problemas de calibración. Si la línea base no es estable, la integración de los picos es menos fiable y los porcentajes calculados a partir de ella son cuestionables. No avances a evaluar los picos si la línea base muestra anomalías evidentes.
2. 2 Paso
   Localiza el pico principal y evalúa su forma

   El pico principal es el más alto y de mayor área del cromatograma. Corresponde al componente mayoritario de la muestra, que en un COA de péptido debe ser el compuesto buscado. Hay dos características que evaluar de inmediato. La primera es la dominancia visual: el pico principal debe ser claramente más alto que todos los demás picos del cromatograma. Si hay otro pico de altura comparable, la pureza no puede ser elevada, porque ambos comparten una fracción significativa del área total. La segunda es la simetría de la forma: un pico bien resuelto es estrecho y simétrico, con ambas laderas de pendiente similar. Un pico con "hombros" o cola asimétrica puede indicar coelución —que el pico principal se solapa con otro componente de tiempo de retención muy próximo— lo que inflaría artificialmente su área y produciría una pureza sobreestimada. Un pico principal con hombros o asimetría evidente requiere interpretación con cautela.
3. 3 Paso
   Estima los picos secundarios

   Los picos secundarios son las señales de los componentes minoritarios: fragmentos de la síntesis que no se purificaron completamente, subproductos de la reacción, isómeros o contaminantes relacionados. En un péptido con pureza ≥98% por HPLC, el total de los picos secundarios debe representar como máximo el 2% del área total. Para evaluarlo visualmente sin software de integración, aplica este razonamiento: si la suma visual de todos los picos secundarios del cromatograma parece representar más del 2–3% del área del pico principal, entonces la pureza declarada del 98% o superior no puede ser correcta. El porcentaje de pureza alto es matemáticamente incompatible con picos secundarios visualmente significativos. Si los picos secundarios son visibles y de tamaño considerable, el número de pureza declarado no se sostiene sin explicación técnica adicional.
4. 4 Paso
   Verifica la coherencia entre el gráfico y la tabla

   La tabla del COA lista los tiempos de retención, las áreas integradas y los porcentajes de cada pico detectado. El cromatograma es la representación visual de exactamente esa misma información. Los dos deben ser coherentes entre sí. Lo que ves en el gráfico debe ser matemáticamente compatible con los números de la tabla. Si el cromatograma muestra picos secundarios visibles pero la tabla declara una pureza del 99,5%, hay una inconsistencia que necesita explicación: puede deberse a un umbral de integración configurado para excluir picos pequeños (práctica no transparente si no se declara), a un cromatograma no correspondiente a ese lote específico, o a una manipulación del documento. La falta de coherencia entre gráfico y tabla es la señal de alerta más fácil de detectar y la que tiene mayor peso en la evaluación del COA.

El tiempo de retención: qué dice y qué no dice

El tiempo de retención (tR) es el tiempo exacto al que el pico principal alcanza su máximo en el cromatograma. Este parámetro depende del compuesto analizado, del método cromatográfico empleado (tipo de columna, gradiente de solventes, temperatura, flujo) y del instrumento. Para el mismo compuesto analizado con el mismo método en el mismo laboratorio, el tR debe ser consistente de un análisis a otro.

El tR aporta una indicación parcial de identidad: si el laboratorio proporciona el tR esperado para ese péptido con ese método, y el valor del análisis está dentro del rango habitual, eso añade coherencia al resultado. Si el tR difiere significativamente del esperado, puede indicar que el pico principal no corresponde al compuesto declarado.

Qué confirma un cromatograma HPLC y qué queda fuera de su alcance

Entender los límites del HPLC es parte fundamental de saber leer un cromatograma. La técnica es rigurosa dentro de su ámbito, pero ese ámbito tiene fronteras claras.

Marco regulatorio en España: AEMPS, EMA y el papel del COA

En España, el organismo competente en materia de medicamentos y productos sanitarios es la AEMPS (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios), con sede en Madrid. Su marco de actuación abarca la autorización de comercialización de medicamentos, la supervisión de la cadena de suministro y la vigilancia del mercado farmacéutico. La venta online de medicamentos está regulada por el Real Decreto 870/2013.

Los péptidos agonistas del receptor GLP-1 con autorización de comercialización como medicamentos en España —semaglutida, aprobada como Ozempic® y Wegovy® para indicaciones específicas, y tirzepatida, aprobada como Mounjaro® en Europa— tienen ficha técnica pública en el registro de la EMA (ema.europa.eu) y son accesibles únicamente a través del canal farmacéutico y bajo prescripción médica. La retatrutida se encontraba, a la fecha de este artículo (julio de 2026), en fase de investigación clínica avanzada y no contaba con autorización de comercialización vigente en España ni en la Unión Europea. Consulta el estado actualizado de cualquier compuesto en el portal de la AEMPS (aemps.gob.es).

Ningún cromatograma de HPLC, por completo y bien ejecutado que sea, sustituye al marco regulatorio de la AEMPS sobre los medicamentos autorizados, ni otorga idoneidad clínica al compuesto analizado, ni reemplaza la supervisión de un profesional sanitario colegiado.

Señales que delatan un cromatograma inconsistente

Una vez internalizados los cuatro pasos, hay patrones de inconsistencia que se detectan de forma rápida y directa:

• El porcentaje de pureza no cuadra con los picos visibles. Si visualmente los picos secundarios suman claramente más del 2–3% del área del pico principal, el número de pureza del 98% o superior es matemáticamente inviable con ese gráfico.
• Ausencia total de cromatograma. Un COA que declara una pureza en una tabla pero no incluye el gráfico que la respalda no constituye evidencia analítica. El número sin el gráfico es verificable; el número solo no lo es.
• Un solo pico perfecto y nada más. En la práctica, cualquier muestra real de péptido sintético contiene trazas de impurezas. Un cromatograma con un único pico perfecto y línea base absolutamente plana sin ningún pico secundario, ni el más pequeño, puede indicar que el rango de integración está configurado para ignorar todo lo pequeño, o que el gráfico no corresponde a la muestra del lote.
• La señal no vuelve a la línea base al final del análisis. Indica que hay componentes con tiempo de retención largo que no han eluido completamente. El cromatograma está incompleto y la pureza calculada puede estar sobreestimada porque esos componentes no se han sumado al área total.
• El lote del COA no coincide con el lote del producto. Un COA impecable de un lote diferente al que se recibió no certifica el producto en cuestión. El número de lote del documento debe coincidir con el del envase.